Опыт использования енисамиуму йодида в клинике

обзор

Ю.В.Марушко, Т.В.Гищак

Введение.

Острые респираторные заболевания (ОРЗ) по данным ВОЗ находятся на первом месте в структуре заболеваемости населения. Среди всех ОРЗ львиную долю занимают вирусные инфекции, часто характеризуются тяжелым течением и присоединением осложнений. В частности, по данным Всемирной организации здравоохранения известно, что во время эпидемии гриппа тяжелое течение заболевания встречается в 3-5 миллионов случаев [29], что приводит к примерно 1000000 смертей в год [28]. А последняя пандемия вируса гриппа H1N1 в 2009 году, охватившего 74 страны, за 2 месяца забрала около 20000 человеческих жизней [25]. В общем гриппом в общей популяции ежегодно страдают около 20-30% детей и 5-10% взрослых [28].
Многократные атаки вирусов и бактерий при респираторных инфекциях приводят к нарушениям компенсаторно-адаптационных механизмов и снижение иммунорезистентности, что может способствовать возникновению осложнений как местных (отиты, синуситы, бронхиты, пневмонии), так и общих (формирование иммунокомплексной патологии), а также хронизации процесса .
Исследованиями последних лет доказано, что слишком большое или неконтролируемое высвобождение провоспалительных цитокинов, происходит при тяжелых вирусных инфекций, может привести к «цитокиновой бури» — полиорганного поражения и даже летальному исходу [22]. Например, исследования о связи между вирусной нагрузкой и цитокинами пациентов с H7N9 в провинции Гуандун, Китай, в течение 2013-2014 гг., показало, что существует положительная корреляция между вирусными титрами в различных клинических пробах и уровнями цитокинов в плазме и бронхоальвеолярной жидкости. В частности, в плазме и бронхоальвеолярной жидкости выявлено повышение регуляции провоспалительных цитокинов ИP-10, MCP-1, МИG, МИP-1α / β, IL-1β и IL-8 [30]. Повышенные уровня IP-10, MIG, MIP-1β, MCP-1, IL-6, IL-8 и IFN-α были обнаружены в сыворотке в острых пациентов с инфекцией H7N9, которые были значительно выше, чем у здоровых участников исследования. Некоторые низкопатогенного вирусы птичьего гриппа, такие как вирус птичьего гриппа А (H9N2), также могут способствовать выражению провоспалительных цитокинов и хемокинов в эпителиальных клетках дыхательных путей человека [19]. Подобные выводы наблюдались у пациентов с тяжелым гриппом A (H1N1) и сезонным гриппом [23]. Есть данные, что дисрегуляция цитокинов способствует патогенеза вирусов H5N1 и H7N9, которые вызывают тяжелое заболевание органов дыхания [32]. Кроме того, уровни цитокинов положительно коррелируют с длительной госпитализацией и уровнями С-реактивного белка и негативно соотносятся с индексом оксигенации [20]. Другое исследование показало уровень IP-10 и IL-6 как биомаркеров для тяжелых случаев заболевания H7N9 [17].
Эти данные несколько меняют взгляд клиницистов на использование препаратов с противовоспалительным действием при вирусных инфекциях [26]. Все больше утверждается мнение о том, что лечение вирусных инфекций должно поддерживать баланс между противовирусным и противовоспалительным эффектом [24, 31].
Таким образом, терапия ОРЗ должна быть комплексной и включать в себя эффективную борьбу с вирусами, повышение иммунитета, облегчение течения заболевания и снижение риска осложнений.
В действующих нормативных документах Минздрава Украины, регламентирующих ведение взрослых и детей с гриппом и ОРЗ [9], особенно подчеркивается необходимость избегать полипрагмазии при терапии неосложненных острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ), дифференцированно подходить к назначению антибиотиков, рационально организовывать симптоматическую терапию. Решению этих вопросов помогает назначения лекарственных средств, способных комплексно воздействовать как на этиологические факторы ОРЗ, так и на патогенетические механизмы развития заболевания. К таким лекарственным средствам с полной уверенностью можно отнести енисамиум йодид.
Цель работы — обобщить данные литературы и собственный опыт применения енисамиум йодида в клинической практике.
По своей химической структуре енисамиум йодид представляет собой производное изоникотиновой кислоты. Прямая противовирусная активность енисамиуму йодида сочетается с выразительным иммунокорригирующим и противовоспалительным эффектом, удачно отличает препараты на его основе от других подобных средств.
При гриппе противовирусное действие енисамиум йодида связано с воздействием на гемаглютинины вируса, вследствие чего вирион теряет способность присоединяться к клеткам-мишеням для дальнейшей репликации [15, 16, 18].
В экспериментальных исследованиях выявлено, что енисамиум йодид заметно подавляет репликацию вируса гриппа и снижает экспрессию вирусного М-гена в клетках в бронхиальных эпителиальных клетках человека [18, 21]. А клиническими исследованиями было убедительно доказано, что енисамиум не только дозозависимо снижает репликацию вирусов гриппа (в том числе H1N1), но и выявляет эффективность против штаммов вируса, резистентных к озельтамивиру. При низких дозах инфицирования эффект препарата более заметен, и максимальная эффективность отмечается при применении в течение первых 8 часов с момента заражения [1].

Доказано противовирусное эффективность енисаниуму относительно респираторно-синцитиальный, адено- и коронавирусов, особенно в первые 4 часа после инфицирования [14].
Противовоспалительное действие енисамиуму является результатом стабилизации клеточных и лизосомальных мембран, замедления дегрануляции базофилов, антиоксидантного действия, нормализации уровня простагландинов, циклических нуклеотидов и энергетического обмена в очаге воспаления. Кроме того, енисамиум йодид влияет на терморегулирующие центры мозга и ретикулярную формацию, благодаря чему проявляется его анальгезирующее и жаропонижающее эффект.
Клинические наблюдения показали, что за жаропонижающим и противовоспалительным действием енисамиум имеет существенные преимущества перед салицилатами и ибупрофеном, а его анальгезирующее активность соответствует активности метамизону [12].
Особого внимания заслуживает влияние енисамиуму на иммунную систему, что делает его применение особенно ценным для профилактики тяжелых осложнений и хронизации воспалительных респираторных заболеваний.
Енисаниум способен моделировать продукцию цитокинов и интерфероногенеза, увеличивать уровень лизоцима и титров антител к возбудителям респираторных инфекций, стимулировать функциональную активность Т-лимфоцитов и макрофагов [7, 12].
На фармацевтическом рынке Украины енисамиум йодид представлен в виде сиропа Амизончик и таблеток Амизон, которые назначают детям в возрасте от 3-6 лет и детям от 6 лет и взрослым соответственно.
Клиническая эффективность препаратов на основе енисамиуму йодида подтверждается многими клиническими исследованиями, в том числе международными.
В проспективное простое слепое сравнительное клиническое исследование по изучению эффективности и безопасности препарата Амизон [11] были включены пациенты 18-60 лет преимущественно с гриппом (А и В) и аденовирусной инфекцией, которые были разделены на 2 группы. В основную группу вошли пациенты, получавшие Амизон, в группу сравнения — те, что получали плацебо. Курс лечения составил 7 дней. В результате исследования было выявлено, что применение препарата Амизон на ранних сроках ОРЗ (в том числе гриппа) способствовало более быстрой ликвидации основных симптомов заболевания и снижение степени их выраженности, сокращению продолжительности выделения вирусных антигенов с носовых смывов. Так, на 30-й день от начала терапии вирусные антигены определялись только в 28,3% случаев в группе пациентов, принимавших Амизон, и в 72,5% случаев в группе пациентов, получавших плацебо. На 7-й день терапии вирусные антигены продолжали идентифицироваться в 1,7% случаев пациентов, лечившихся Амизоном, и в 15% случаев пациентов, получавших плацебо [11].
В Санкт-Петербурге сотрудниками НИИ гриппа РАМН проведено проспективное простое слепое сравнительное клиническое изучение эффективности и безопасности препарата Амизон на 100 больных ОРВИ и гриппом [7]. Интересным представляется тот факт, что в исследование были включены пациенты, которые заболели не более, чем за сутки до исследования. Это имеет смысл с точки зрения предполагаемого механизма действия Амизона, поскольку противоинфекционные свойства препаратов интерферона и их индукторов эффективно проявляются на ранних стадиях болезни. Исследование проводилось с соблюдением всех норм надлежащей клинической практики. В процессе лечения исследователи оценили клиническую динамику заболевания в репрезентативных группах пациентов, болеющих гриппом А, В, аденовирусной инфекции и их сочетанные формы, по специальной 4-балльной шкале. Исследования показали статистически значимую положительную динамику температурной реакции до 3-го дня от начала лечения Амизоном в 73,3% пациентов и только в 57,7% в контрольной группе. Кроме того, продолжительность лихорадочного периода у больных, принимавших Амизон, сокращалась на 1,1 дня. Аналогичная картина наблюдалась относительно изменений общего самочувствия пациентов. Так, в группе, которая была пролеченная Амизоном, улучшение самочувствия отмечали 43,3% больных, а в контрольной — только 15% больных. На 7-й день заболевания 59 из 60 пациентов основной группы вернулись к обычному распорядку жизни, тогда как 37,5% больных контрольной группы все еще чувствовали ухудшение самочувствия и не могли вернуться к обычному расписанию дня. Жалобы на слабость к 3-му дню от начала лечения сохранялись у 70% пациентов основной группы и в 97,5% больных в группе плацебо. До 7-го дня от начала лечения среди пациентов, принимавших Амизон, тех, кто испытывал головную боль, было в 3 раза меньше, чем в контрольной группе. В основной группе больных динамика исчезновения катаральных симптомов имела более выраженный характер, чем в контрольной группе. Так, кашель сохранялся у больных контрольной группы до 14-го дня заболевания в 10 раз чаще, чем в основной. Аналогичная картина имела место для таких симптомов, как ринит и гиперемия зева [7].

Применение Амизона способствует сокращению периода лихорадки, быстрому уменьшению интоксикационного и катарального синдромов, сокращению количества вирусов в смывах из носа: на 2-м визите количество вирусов в назальном секрете уменьшилась более чем вдвое, а на 4-м их уже почти не проявляли [3] .
По данным Ольховской и соавторов [10], проводившие изучение эффективности применения препарата Амизончик у детей 3-12 лет с среднетяжелыми ОРВИ, комплексная терапия с применением Амизончик способствовала быстрой нормализации температуры тела, отказ от необходимости применения таких жаропонижающих препаратов, как ибупрофен и / или парацетамол, сокращению периода лихорадки по сравнению с детьми, получали симптоматическую терапию. При этом достоверно быстрее по сравнению с детьми, получавшими другие противовирусные препараты и симптоматическую терапию, исчезали сухой кашель, выделения из носа, нормализовалась физикальное картина в легких. Комплексная терапия с применением препарата Амизончик приводила к быстрому восстановлению показателей периферической крови по сравнению с детьми, получавшими только симптоматическую терапию. Кроме клинической эффективности, авторами было доказано положительное влияние енисамиуму на динамику уровней цитокинов — в период реконвалесценции показатели ИL1-β и ФНПα достоверно не отличались от физиологической нормы, в то время как у детей, получавших только симптоматическую терапию, эти показатели оставались достоверно высокими. В период реконвалесценции у детей, получавших Амизончик по сравнению с детьми, получавшими другие противовирусные препараты, происходили более значимые изменения со стороны иммунной системы: повышение CD4 + и CD16 + — клеток, концентрации sIgA и лизоцима.
Проведенные нами исследования [4-6] показали клиническую эффективность применения препарата Амизончик у детей, а также положительное влияние комплексной терапии и использования Амизончик на состояние местного иммунитета верхних дыхательных путей. Так, иммунологические исследования ротоглоточный секрета (РС) проводили в соответствии с методическими рекомендациями Института отоларингологии (Д.И. Заболотный и соавт., 2008). Исследовали уровень цитокинов — α-интерферона и интерлейкина-1β (Цитокин, РФ) и макрофагального воспалительного протеина — MIP-1α (реактивы фирмы eBioscience, Австрия), иммуноферментный анализатор (Stat Fax 2100 США).
В ходе проведенного нами исследования препарат Амизончик в комплексной терапии был применен в 36 детей в возрасте 3-6 лет с повторными эпизодами ОРЗ (преимущественно острыми бронхитами легкой или средней степени тяжести). Дети контрольной группы получали комплексную терапию без применения Амизончик.
Для оценки динамики субъективных и объективных данных мы использовали визуально-аналоговую 4-х балльную шкалу. По 0 баллов принимали отсутствие данного симптома, по 3 балла — максимальный его проявление. Так при оценке общего состояния по 3 балла принимали состояние средней тяжести, по 2 балла — легкий, 1 балла — удовлетворительное общее состояние. При проведении орофарингоскопии 3 баллам отвечала разлитая, яркая гиперемия слизистой оболочки ротоглотки, 2 баллам — очерчена, неяркая, 1 баллу — умеренная гиперемия, 0 баллов — отсутствие гиперемии слизистой ротоглотки. В оценке по балльной системе насморка, по 0 баллов принимали отсутствие катаральных проявлений, 1 балла — затруднение носового дыхания или незначительные выделения из носа, по 2 балла — умеренные выделения, по 3 балла — постоянные значительные выделения из носа.
Анализ полученных результатов показал, что на фоне терапии препаратом Амизончик наблюдалась быстрая положительная динамика общего состояния больных детей (улучшение самочувствия и уменьшение интоксикации уже на 2-й день лечения, улучшение аппетита — на 3-й день), а также отдельных клинических симптомов заболевания, в частности кашля и хрипов в легких.
Анализ данных назоорофарингоскопии обнаружил, что гиперемия зева у обследуемых детей в основной группе до начала лечения составила 1,75 ± 0,17 баллов (2,29 ± 0,18 баллов в контрольной соответственно), а балльная оценка проявлений ринита в основной группе — 1 68 ± 0,18 баллов (2,57 ± 0,297 баллов в группе контроля). В динамике лечения гиперемия зева и насморк достоверно уменьшались на третий день на фоне применении Амизончик (1,04 ± 0,13 и 1,07 ± 0,13 баллов соответственно), и только на четвертый день в группе контроля (1,14 ± 0,26 баллов и 1,71 ± 0,18 баллов соответственно).
Об изменениях таких показателей клинической картины, как кашель и хрипы, была обнаружена их достоверная положительная динамика на 4-й день лечения в основной группе, в то время как в контрольной группе кашель уменьшался на 5-й день, а хрипы — на 6-й день терапии.
Исследование ротоглоточный секрета показало положительные изменения каждого исследуемого показателя: снижение повышенных в начале уровней интерферона альфа, провоспалительных цитокинов — интерлейкина-1β и макрофагального общего протеина (МИР1). Таким образом, применение сиропа Амизончик в возрасте 3-6 лет способствовало более быстрому облегчению и исчезновению симптомов ОРЗ, а его клиническую эффективность подтверждала Таким образом, применение сиропа Амизончик в возрасте 3-6 лет способствовало более быстрому облегчению и исчезновению симптомов ОРЗ, а его клиническую эффективность подтверждала положительная динамика указанных иммунологических показателей в ротоглоточный секрете.
Эффективным является также применение енисамиум йодида для профилактики ОРВИ и гриппа. Так, было установлено, что проведение курсов профилактики Амизоном два раза в год, начиная за неделю до сезонного подъема уровня ОРЗ существенным образом (в 3,5-6 раз) снижает частоту повторных ОРВИ в месяце сезонного подъема заболеваемости [13].
При развитии ОРВИ на фоне профилактического приема Амизона у детей 5-12 лет (0,125 г через день в течение 2-3 недель или каждый день 5-7 дней подряд за 7-10 дней до начала сезона повышенной заболеваемости ОРЗ с повтором курса через 2 недели ), течение заболевания облегчался, не наблюдалось осложнений (отиты, пневмонии, синуситы) [13]. Те же авторы рекомендуют применять Амизон с профилактической целью детям 6-12 лет внутрь по 0,125 через день в течение 3-4 недель, в дальнейшем в той же дозе 2 раза в неделю в течение всего периода повышенной угрозы заболевания (2-3 месяца). Подросткам в возрасте 13-16 лет Амизон по 0,25 г через день в течение 2-3 недель, в дальнейшем по 0,25 г два раза в неделю в течение 1-2 месяцев. Авторы утверждают, что такой режим приема препарата способствует повышению уровня α-ИФН в сыворотке крови в 3-4 раза, особенно при его исходном пониженном уровне и в дальнейшем обеспечивает поддержание достаточно высокой концентрации сывороточного интерферона в течение 2-2,5 месяцев [13].
Как показали результаты экспериментальных исследований, а также следующие клинические наблюдения, Амизон малотоксичен, не имеет канцерогенного, тератогенного, мутагенного эффектов. При приеме в терапевтических дозах не вызывает развития любых нежелательных побочных эффектов, в том числе аллергических реакций [11]. Перспективным является внедрение новых форм выпуска препаратов на основе енисамиум йодида.
Таким образом, енисамиум йодид имеет высокий клинический эффект при гриппе и ОРВИ, что обусловлено его доказанной противовирусной, иммуномодулирующим и противовоспалительным действием, и может быть рекомендован для широкого применения у взрослых и детей.

Список литературы:

1. Амізон проти грипу та ГРВІ: результати міжнародного дослідження // Здоров’я України.- 2014.- №21.- С.24-25.

2. Жулай, Т. С. Дослідження дозозалежності антиексудативної дії нового назального спрею з протизапальними властивостями / Т. С. Жулай, С. К. Шебеко, І. А. Зупанець // Клінічна фармація. – 2017. – Т. 21, № 4. – С. 11-16.

3. Исаков В.А. Эффективность Амизона в терапиии профилактике гриппа и ОРВИ. В.А.Исаков, Е.А. Охапкина, В.Д. Евграфов // «Медицинский форум». — 2015. — №1 (2). — С.3-6

4. Марушко Ю. В. Вивчення противірусних, протизапальних та жарознижувальних властивостей енісаміуму йодиду/Ю.В.Марушко // Здоров’я України Тематичний номер «Педіатрія» №3 (42), вересень 2017 р. — С.51.

5. Марушко Ю. В. Клініко-експеериментальна характеристика амізону й досвід застосування в клінічній практиці /Ю.В.Марушко, Е.Е.Сабадаш // Здоровье ребенка. — 2015. — №6 (67). — С.26-31.

6. Марушко Ю. В. Ефективність застосування препарату «Амізончик» при гострих респіраторних захворюваннях у дітей віком 3–6 років / Ю.В. Марушко, О.Ф. Мельников, М.Г. Грачова, О.С. Мовчан // Современная педиатрия. — 2013. — № 4(52). — С. 62-66.

7. Мельникова Т.И. Клиническая эффективность Амизона в терапии гриппа и других острых респираторных вирусных инфекций / [Т.И. Мельникова, Э.Г. Деева, И.В. Амосова и др.] // Здоров’я України. — 2013. — С. 40-41.

8. Мельникова Т.И. Клиническaя эффективность препарата на основе изоникотиновой кислоты в терапии гриппа и других острых респираторных вирусных заболеваний / Т.И.Мельникова, Э.Г Деева, Е.А. Охапкина и др. // Инфекционные болезни, 2012. — № 4. — С.70-75.

9. Наказ МОЗ від 16.07.2014 № 499 «Про затвердження і впровадження медико-технологічних документів зі стандартизації медичної допомоги при грипі і гострих респіраторних інфекціях»

10. Ольховская О.Н. Эффективность применения препарата Амизончик в комплексной терапии детей, больных острыми респираторными вирусными инфекциями / О.Н. Ольховская, С.В. Кузнецов, Т.С. Жаркова // Педиатрия. Восточная Европа. — 2014. — № 1. — С. 92-99.

11. Проспективное простое слепое сравнительное клиническое исследование по изучению эффективности и безопасности препарата «Амизон» таблеток 0,25 г, производства компании ОАО «Фармак» у пациентов с ОРВИ, в том числе гриппом, ttp://www.influenza.spb.ru/science_work/clinical_tests/amizon_3_phase. Accessed November 17, 2014.

12. Фролов А.Ф. Эффективность Амизона в лечении и профилактике вирусных инфекций (к 10-летию применения препарата в клинической практике). /А.Ф.Фролов, В.М.Фролов //Український медичний часопис. — 2005. — №5(49). — С.75-80.

13. Фролов А.Ф. Амизон: опыт применения в педиатрической практике / А.Ф.Фролов , В.М.Фролов, И.В.Лоскутова// Український медичний часопис. — 2000. — №2(16). — С.97-100.

14. 3-rd anivirals congress [Електронний ресурс] – Режим доступу до ресурсу: http://www.antivirals.elsevier.com/conference-programme.html.

15. Boltz D. Antiviral effect of a derivative of isonicotinic acid enisamium iodide (FAV00A) against influenza virus / Boltz D, Cocking D, Cinatl J et al. Programme and Abstract Book, 5th ISIRV AVG Conference, Shanghai, China, 2017. — P. 110.

16. Boltz D. Antiviral Activity of Enisamium Against Influenza Viruses in Differentiated Normal Human Bronchial Epithelial Cells / Boltz D., Peng X, Muzzio M. Et al. // (2014) 3rd Antivirals Congress (October 12-14, 2014) Amsterdam, Netherlands.

17. Chi Y. Cytokine and chemokine levels in patients infected with the novel avian influenza A (H7N9) virus in China / Chi Y, Zhu Y, Wen T, et al. // J Infect Dis. — 2013. — №208. — P.1962-1967.

18. Cocking D. Antiviral effect of a derivative of isonicotinic acid enisamium iodide (FAV00A) against influenza virus /Cocking D, Cinatl J, Boltz DA, Peng X, Johnson W, et al. / Acta Virol. — 2018. — № 62(2). — P.191-195.

19. Farzin H. Up-Regulation of Pro-Inflammatory Cytokines and Chemokine Production in Avian Influenza H9N2 Virus-Infected Human Lung Epithelial Cell Line (A549) /Farzin H, Toroghi R, Haghparast A.// Immunol Invest. — 2016. — №45. — P.116-129.

20. Hagau N. Clinical aspects and cytokine response in severe H1N1 influenza A virus infection / Hagau N, Slavcovici A, Gonganau DN, et al.// Crit Care. — 2010. — №14. — P.R203.

21. Haltner-Ukоmadu E. In Vitro Bioavailability Study of an Antiviral Compound Enisamium Iodide / Haltner-Ukоmadu E, Gureyеva S, Burmakа O, et al. // Sci Phаrm. — 2018. — № 11;86(1). — Р. pii: E3.

22. Jingxian Chen R.Z. Clinical Virology /Jingxian Chen RZ, Tao Peng, Dapeng Xiang, Mingli Wang // China Science Publishing & Media Ltd, 2012. — Р.950-983.

23. Lee N. Cytokine response patterns in severe pandemic 2009 H1N1 and seasonal influenza among hospitalized adults /Lee N, Wong CK, Chan PK, et al.// PLoS One. — 2011.- №6. — Р.e26050.

24. Li Z. Re-undеrstаnding anti-influenzа strategy: attаch еqual importance to antiviral аnd anti-inflammatory th erapies/ Li Z, Li L, Zhao S et al.// Thorac Dis. — 2018. — №10 (Suppl 19). — P. S2248-S2259.

25. Michaelis M. An influenza A H1N1 virus revival — pandemic H1N1/09 virus /Michaelis M, Doerr HW, Cinatl J. et al // Infection. — 2009. — №37. — P. 381-389.

26. Peiris J.S. Host response to influenza virus: protection versus immunopathology /Peiris JS, Hui KP, Yen HL.// Curr Opin Immunol. — 2010. — №22. — P. 475-481.

27. Tisoncik J.R. Into the eye of the cytokine storm /Tisoncik JR, Korth MJ, Simmons CP, et al. //Microbiol Mol Biol Rev. — 2012. — №76. — P. 16-32.

28. Vaccines against influenza WHO position paper — November 2012. Wkly Epidemiol Rec. — 2012. — №87. — P.461-476.

29. World Health Organization. Influenza, режим доступу: http://www.who.int/ru/news-room/detail/14-12-2017-up-to-650-000-people-die-of-respiratory-diseases-linked-to-seasonal-flu-each-year

30. Yang Z.F. Clinical, virological and immunological features from patients infected with re-emergent avian-origin human H7N9 influenza disease of varying severity in Guangdong province / Yang ZF, Mok CK, Liu XQ, et al. // PloS one. — 2015. — №10. — P. e0117846.

31. Yip T.F. Advancements in Host-Based Interventiоns for Influenza Treatment Yip TF, Selim ASM, Lian I, Lee SM. // Front Immunol. — 2018. — № 10 (9). — Р. 1547.

32. Zhou J. Biological features of novel avian influenza A (H7N9) virus /Zhou J, Wang D, Gao R, et al.// Nature. — 2013. — №499. — Р. 500-503.